分子间相互作用分析仪(Monolith)

 

采用最新的生物分子间相互作用分析技术——微量热泳动(Microscale Thermophoresis, MST),是由总部设在慕尼黑的德国高科技公司NanoTempe研发和生产。2010年底一篇Nautre文章《Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis》最先报道了NanoTemper公司创始人Dr. Stefan和 Dr. Philipp使用MST测量生物溶液中蛋白-蛋白之间的相互作用,引起了很多科研人员的极大兴趣,随后该产品正式投入全球市场。仅在2012-2014年,就有250个国外的实验室购买和使用,目前全球已超过350台仪器在为科学家提供服务,其中中国已有近60台(包括北大,清华,复旦,中大,中科院,中国药大,中国农大等科研单位)。截止到2016 年,利用该技术共发表 Cell、Nature、Science、PNAS 等期刊文献多达1200篇。

 

1、技术原理

微量热泳动(Microscale Thermophoresis, MST)是指分子在微观的温度梯度场中的定向运动。有的分子会从高温区向低温区定向运动(正向热泳动),有的分子会从低温区向高温区定向运动(负向热泳动)。分子热泳动的方向和速度等性质取决于分子的大小、电荷和水化层。当靶分子与配体发生相互作用形成复合物时,其大小、电荷和/或水化层会发生变化,造成热泳动性质的变化。

NanoTemper公司生产的Monolith系列微量热泳动仪正是利用靶分子与配体结合前后热泳动性质的差异来判断有无结合并且计算亲和力的大小。Monolith系列微量热泳动仪通过荧光检测器来检测毛细管中样品的分布情况。当对毛细管中极小区域进行加热时,该区域的样品会发生热泳动,样品浓度会发生变化从而导致荧光值发生变化。由于单体靶分子与复合物的热泳动性质不同,热泳动造成的荧光值变化幅度也不同。实验时无荧光的配体进行梯度稀释并与恒定浓度的荧光靶分子混合从而获得复合物比例不同的样品;因为加热前荧光值相同,使用微量热泳动仪测得各个样品热泳动后的荧光值即反映了复合物的比例;将热泳动后的荧光值对配体浓度作图可获得结合曲线,进而计算得到亲和力大小,即平衡解离常数。

Monolith系列微量热泳动仪具有一系列的优点:不依赖热量变化,对测量环境不敏感;无需进行表面固定,直接在溶液中进行测定;对溶液条件没有限制,可以在任何溶液(血清、细胞裂解液、含高浓度有机溶剂的溶液)中进行测定,样品装载到毛细管中并使用荧光检测技术。灵敏度高,样品用量极少;测定速度快,10-15分钟即可获得解离常数;应用范围广,可检测小到离子大到核糖体范围内的分子相互作用;操作简单。简单培训即可使用;无管路系统、样品池等需要清洗部分,无维护费用。

Monolith系列微量热泳动仪的诸多优点使MST技术成为一种非常受欢迎的分子互作研究手段;使用MST技术,全球数百所大学、研究机构、制药公司的科研人员获得了非常有价值的数据,极大推动了基础研究以及药物研发等领域的发展。

2、主要特点

灵敏度高 

 微量热泳动仪可以测量小到离子或小分子(无分子量下限)大到核糖体(2.5MDa)等亚细胞器甚至是细胞水平的结合。

性能独特

微量热泳动仪操作简单,可以测量各种生物分子的结合并且具有众多扩展应用,即可使用于实验室基础研究,又可用于医药领域的研发和应用,如常规方法很难完成的小分子靶标筛选等:

l  测量任何(生物、纳米材料)分子间的亲和力

l  直接在脂质体或者去污剂中研究膜蛋白

l  多组分反应,复合物形成、装配顺序、干扰因素

l  研究血清、细胞裂解液或者其他生物溶液中分子间相互作用

l  区分真正的结合和分子寡聚化以及其它假象

l  可以使用荧光标记或者非荧光标记测量

l  使用GEP融合表达蛋白可以在天然环境下完成测量而不需要纯化

l  区分靶标上不同的结合位点

l  研究化学计量学并确定生物分子结合位点的数目

l   研究结合能量学ΔG (自由能 ), ΔH (焓) 和ΔS (熵)

l  直接或间接测量抑制物亲和力、ki

环境天然

微量热泳动仪无需进行表面固定直接在溶液中进行测定,可以在接近天然环境之中检测分子间结合和生化活性:

l  无需固定

l  无溶液选择性,可以在标准特定溶液中或者在血清和细胞裂解液等复杂生物溶液中测量

l   可以选择测量的温度 

耗材便宜

使用毛细管而无需昂贵的芯片,大大降低了实验成本。毛细管样品托上可以一次放置16根毛细管,也可以只使用2-3根毛细管来完成小规模的预实验。
       样品量少

每根毛细管中只需要4-6ul样品,浓度最低只需要1nM/10nM(不同型号),极大节省了样品。微量热泳动仪只需要其他技术1/100的样品量。

无需维护

微量热泳动仪无复杂的管路系统,使用后无需清洗,无维护费用。

 

3、操作步骤

使用微量热泳动仪进行实验操作非常简单,主要包括以下几个步骤:

1. 使用荧光染料标记、融合荧光蛋白或者或化学偶联等方法使待研究结合分子中的一个带上荧光。NanoTemper提供用于MST分析的各种蛋白标记染料;当然,使用NT.LabelFree紫外模块进行检测不需要额外荧光标记。

2. 荧光标记分子的浓度的保持不变,而另外一个非标记荧光染料的分子进行梯度稀释,最多可以做16个浓度阶梯。两者混合后孵育一段时间使反应达到平衡。

3. 样品高速离心后利用毛细现象将上清吸入毛细管中,毛细吸管转移到样品托上,样品托最多可以放置16根毛细管。

4. 启动软件后,选择合适的检测通路;MST设备会自动识别样品托上毛细管的位置;15分钟之间MST设备就会自动完成每根毛细管中样品热泳动数据的测量并计算出解离常数。

 

4、应用案例

 

 

 

 

 


 

 

 

l  蛋白与离子                  l  脂类环境中测定    

l  蛋白与化合物               l  复杂环境中测定

l  蛋白与多糖                  l  无需纯化测定

l  蛋白与多肽                  l  高通量筛选

l  蛋白与核酸                  l  竞争性结合

l  蛋白与蛋白                  l  化学计量数

l  蛋白与纳米颗粒           l  结合能

l  核酸与化合物              l  蛋白构象变化

l  核酸与核酸                 l  酶动力学

 


 


 

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