什么是数字PCR?

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       提起PCR,在生物及其相关行业内可谓无人不知无人不晓,半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术特别是PCR技术日新月异的进步。1983年由美国Mullis首先提出设想,1985年发明了聚合酶链反应,即简易DNA扩增法,标志着PCR技术的真正诞生。1999 年,美国学者 Kenneth Kinzler 与 Bert Vogelstein 首次提出了数字 PCR (digital PCR,dPCR)的概念,实现了核酸拷贝数绝对定量的突破,成为一种全新的核酸检测方法,与传统PCR技术相比,具有高灵敏度、高精准度、高耐受性和绝对定量的优点。那么这项技术究竟有何神通之处?有哪些广阔的应用前景呢?

 

一、基础研究篇

 

1. 基因表达差异研究 

数字PCR由于检测时完全不依赖传统的Ct值即可实现真正意义上的绝对定量,因而可以提供比实时荧光定量PCR更精确的基因差异表达研究,尤其对于那些靶基因表达差异微小的情况,如:mRNA、microRNA、lncRNAs等的表达分析;等位基因的不平衡表达;单细胞基因表达分析;外泌体核酸分子定量分析等。

2. 拷贝数变异(CNV)研究

微滴化的样品处理及检测,这种摆脱Ct值的计算方法而直接获取目标基因的绝对拷贝数,为拷贝数变异的研究提供了绝对的检测精度。是其他诸如二代测序、芯片杂交等平台无法达到的。采用数字PCR能够有效对二代测序(NGS)和微阵列比较基因组杂交(aCGH)等实验结果进行验证,并具有检测周期短、成本低、样本通量高等特点。

3. 低丰度DNA模板分子的精确定量

由于绝大部分微液滴中只含单个或不含模板分子,使得低丰度DNA模板分子的扩增不受高丰度模板分子扩增的竞争抑制:与此同时,样品中可能存在的抑制剂也在分配到微液滴的过程中进行了相对稀释,作用于单个微液滴内模板扩增的抑制剂数量大幅降低,从而提高PCR扩增对抑制剂的耐受程度,因此可应用于诸多临床样品(如血液、尿液、粪便、痰液、胸腹水、脑脊液等)中痕量核酸标记物的检测。一般而言,毛细管电泳和定量PCR的检测灵敏度约在10%,NGS的灵敏度可达到1%,而数字PCR的检测下限可轻松实现0.001%。

4. 甲基化含量鉴定

作为表观遗传学研究中重要的一个研究方向——甲基化程度分析,现阶段有不同的方法或技术来进行研究:如传统的亚硫酸氢盐处理后的克隆测序法、抗体检测法、定量PCR检测法等受限于方法学的问题,不能获得甲基化程度的精确定量,而数字PCR系统通过对样品的微液滴处理及目标分子的绝对拷贝数定量,为甲基化程度的精确定量检测提供了一种可靠的技术。

5. 二代测序辅助建库

目前靶向测序建库方法包括扩增子方法,在均相溶液中,当扩增引物增加时,由于扩增引物之间的相互作用,从而影响扩增的效率;如果将其分散到大量微液滴中扩增,将可大大降低引物间相互作用,提高扩增效率。同时还可以实现对于少量模板的有效扩增,得到更多的有效测序数据。

6. CRISPR-Cas9基因编辑结果验证

CRISPR-Cas9技术的发明,是基因编辑技术的一大突破,但如何验证实验是否成功,仍需要高灵敏度的检测方法,数字PCR技术可以满足这一需求。Broad研究所张锋团队发明了以CRISPR为基础的SHERLOCK技术可以对核酸进行高灵敏度的定性检测,但精确定量评估时仍采取了数字PCR进行确认。

 

二、疾病研究篇

 

7. 肿瘤的液体活检

肿瘤学研究是数字PCR的重要应用领域,该技术作为极为重要的工具,能够识别DNA突变(例如EGFR)、肿瘤患者用药监控、基因扩增检测、循环肿瘤细胞(CTC)特性研究、长链非编码RNA检测、液体活检中循环的核酸(cfDNA)和肿瘤细胞(CTC)的绝对定量等研究中。

癌症标志物稀有突变检测

在一份给定的样本中,相比于野生型DNA,癌症相关的突变序列比例较低,经常无法检测。而凭借其超高灵敏度,dPCR系统可以很容易地定量分析低至0.001%-0.0001%的突变频率。之前用任何方法都无法实现准确稳定检测的样本,现在可以使用dPCR轻松进行定量分析。例如,已实现肺癌相关的表皮生长因子受体(EGFR)中T790M突变的检测,可以更好地评估抗酪氨酸激酶抑制剂的治疗。

肿瘤治疗的伴随诊断

常用体液来源(如血液,胸腹水,唾液及尿液等)的待检标本中的DNA,有正常脱落体细胞和病变脱落细胞两种来源,前者的量远大于后者。通过微液滴处理能在每个微液滴中有效减少正常体细胞DNA的干扰,实现肿瘤标记物的有效检测,如EGFR,ALK,ROS1,KRAS、BRAF等基因的突变检测、乳腺癌/胃癌的HER2基因扩增检测等,应用于肿瘤精准医学的伴随诊断。

肿瘤治疗的实时监控

已有数篇文章报道了使用数字PCR技术对患者治疗过程中的循环肿瘤DNA(ctDNA)进行检测,实时监控疾病进展。在非小细胞肺癌、乳腺癌和肠癌等多种肿瘤患者中都取得了令人鼓舞的结果。与影像学及其他常规指标相比,ctDNA突变及丰度改变通常会提前数月出现,这样就可以提醒医生及时调整治疗方案,使患者得到更有效的治疗。

8. 糖尿病

数字PCR技术目前在糖尿病中的研究热点,通过定量检测非甲基化DNA的水平,对I型糖尿病β细胞死亡进行定量,从而监控病情发展。

9. 无创产前筛查

无创伤的产前诊断, 如21号染色体为3倍体的唐氏综合征、已知父母基因型的胎儿地中海贫血或胎儿遗传性耳聋基因检测等。目前无创检测标本来源主要为孕妇血液,而待检测的胎儿DNA受到母体DNA的干扰,影响了检测的准确性。数字PCR技术可以作为二代测序法的补充来进行无创伤产前诊断,从而提高工作效率、降低检测成本。

10. 致病微生物(病毒、细菌等)的检测

疾病预防控制中心、出入境检验检疫局系统的实验室可以将基于TaqMan探针法的定量PCR体系无缝地转移到数字PCR上,从而满足该类实验室对于检测结果的要求:灵敏度更高、重复性更好、无需依赖标准曲线的绝对定量结果,同时操作简便。

11. 肥胖

数字PCR技术能够检测到引起肥胖的重要因素之一AMY1(唾液淀粉酶)的基因拷贝数。

12. 传染性疾病

数字PCR技术因起高精密度、耐受能力强、高灵敏度等优点,逐渐被用于病毒载量分析的相关研究。如HIV抗逆转录病毒治疗过程中病毒残留量的监控;HBV耐药突变的检测;HCV的分子分型;抗甲氧西林金黄色葡萄球菌的院内感染监控;环境微生物不同功能基因之间的连锁分析等等。

13. 移植排斥监控中的应用

为了降低器官移植中移植物排斥导致的风险,数字PCR技术通过监测受体中移植器官供体的循环DNA水平来检测早期移植排斥。

14. 肠道菌群分析

数字PCR技术直接计算目的序列的拷贝数,对样品中的微生物实现了绝对定量,可用于微生物检测,以便进一步研究肠道菌群的结构、功能以及数量。

 

三、其他领域篇

 

15. 转基因食品或成分的检测

目前在确定转基因作物或成分的含量时采取定量PCR的标准曲线法,这种方法需要依赖于已知浓度的标准品(Certified Reference Materials Calibrants, CRMCs)。ddPCR绝对定量的方式可以彻底解决这些标准物质的定标工作,从而确保安全和品质。

16. 环境监测

基因目标的环境监测,需要对复杂样品中低浓度的目标进行准确检测。ddPCR每次运行中能创建数千个PCR反应室,带来了目标的准确测定,即使它们浓度很低,因此可以实现对土壤、污水、淤泥、酒泥等为样本的环境生物学研究和病原微生物监测。

17. 基因型鉴定

PCR也可以用于检测一个生物中是否存在某特定DNA序列,这被称为基因型鉴定。例如,基因型鉴定可通过发现样品中是否存在某种群特异性序列来判断样本的真实性。基因型鉴定还可用于法医分析判断在现场发现的DNA样品是否和嫌疑人的吻合,令凶手无处遁形。

18. 早期精准检验疫情

2016年,全球首例数字PCR动物疫病检测试剂研发成功,包括禽流感、禽流感H7N9、蓝耳病、高致病性美州株、猪的流行性腹泻等动物疫病检测试剂盒。此项技术的推出,将有助于在食品安全的源头及早发现疫情,尽早处理避免更大面积的传染,更好地控制漏检,减少传染人的几率;也将有助于国家建立规范化、规模化的动物疫病新型检测方法。

19. 药物基因组检测

能够通过PCR技术实现药物基因组的检测,提高合理用药水平,具有通量较高,操作简单,仪器设备易普及等优点。

番外

 

数字PCR冷知识:胎儿性别不是只有B超可以看出来,一只精通数字PCR的科研狗,也可以测出来。

综上,数字PCR技术影响之深、应用之广可见一斑,如今,科学界对于数据准确性和结果可靠性的要求越来越高,更多的实验室将目光转向拥有绝对定量方式、高灵敏度和高重复性特质的数字PCR技术。数字PCR是目前非常重要的核酸分子诊断技术之一,可以说是未来临床分子诊断的关键平台。随着其应用领域的不断延伸,我们有理由期待数字PCR技术在经历过逐步发展和自我完善后,发挥巨大潜力,成为新一代分子诊断的标准工具。

 

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2019年9月11日 13:47
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