战胜新型冠状病毒可用之利器,从抗病毒药物筛选到疫苗开发(一)

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2020年新年伊始,武汉新型冠状病毒感染肺炎的疫情牵动着社会各界的心。

在本次疫情开始之际,安捷伦有幸向中科院武汉病毒研究所和中国疾病预防控制中心病毒病所捐赠xCELLigence RTCA系统。协助两家国家重点病毒科研单位用于病毒CPE(细胞病变效应),抗病毒药物和疫苗的研究,集中力量,快速突破,攻克技术难关,遏制病毒蔓延。

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安捷伦技术支持王颖在受捐单位国家病毒病所仪器培训后和老师合影

 

xCELLigence RTCA实时细胞分析检测技术可满足研究人员尽可能少地接触病毒,并可以做到无需研究人员值守的病毒研究任务。有效保证研究过程中相关人员的安全,且不耽误研究进程,从而协助攻关专家,助力病毒研究。

xCELLigence RTCA 实时细胞分析技术是一种活细胞检测技术。该技术可实现无标记和持续性的跟踪记录病毒感染细胞过程中CPE的进展,为多种病毒学检测提供简易的实验流程,包括但不限于:病毒滴度测定、疫苗研发、中和抗体的检测与定量和抗病毒药物的开发等。 

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一、病毒CPE和滴度研究
美国加利福尼亚大学疾病研究中心的Reisen及其同事使用xCELLigence RTCA测定了西尼罗河病毒(WNV)和圣路易斯脑炎病毒(SLEV)的病毒滴度。未感染的对照细胞正常生长至汇合,并维持稳定的细胞指数。感染病毒的细胞显示出时间和剂量依赖性的细胞指数降低,表明细胞被感染后已完全裂解死亡(下图A和B的上图)。两种病毒均表现出CPE动力学,该动力学与病毒的已知效价相关。通过绘制CIT50(细胞指数降低50%所需的时间)与病毒滴度的曲线,可以突出显示这一点(下图A和B的下图)。使用这种类型的标准曲线,可以轻松确定未知浓度样品中的病毒滴度。

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A和图B. 使用xCELLigence RTCA确定病毒滴度。 实时检测不同浓度WNV(图A上)和SLEV(图B上)诱导的Vero细胞的CPE细胞病变效应。水平线表示细胞指数已降至其初始值的50%(即在添加病毒之前)的点。达到这一点所需的时间称为“ CIT50”。通过CIT50与病毒浓度的关系绘制成一条标准曲线,可用于确定各种类型样品中的病毒浓度。数据摘自参考文献1。

 

二、疫苗研发及中和抗体检测和定量研究

法国Sanofi Pasteur研究所使用xCELLigence RTCA进行登革热病毒CPE和疫苗研发的研究。研究人员先将Vero细胞接种到E-Plate孔板中,再加入不同稀释滴度的登革热病毒或者不同处理组的病毒。他们利用xCELLigence RTCA系统实时追踪记录病毒CPE的发作时间,以及整个过程。同时,通过绘制CITmed(细胞指数降低50%所需的时间)与抗体滴度的标准曲线,量化了阻断病毒CPE的中和抗体浓度。

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图A. 登革热病毒感染后的细胞实时检测结果。xCELLigence RTCA实时检测被感染细胞与未感染的对照Vero细胞的生长曲线,被登革热病毒感染的Vero细胞的生长曲线呈现处明显的差异。同步使用成像法捕获Vero细胞倍登革热病毒感染后的生长状体。数据摘自参考文献3。

图a、图b和图c. 经典CCID50(cell culture infectious dose 50%)病毒滴度检测法与RTCA病毒滴度检测法的相关性。a)RTCA检测不同浓度病毒感染后的Vero细胞的生长曲线;b)通过病毒浓度梯度与CITmed间的关系绘制出标准曲线;c) 使用135个不同的登革热病毒样品,由不同技术人员在八个月内进行评估,比较使用RTCA方法和CCID50方法获得的病毒浓度的相关性。数据摘自参考文献3。

 

三、抗病毒药物的研究

苏黎世分子生命科学研究所的Urs Greber及其同事要确定一种可以减轻腺病毒对感染患者影响的药物。他们在筛选试验中使用了xCELLigence RTCA系统,在不同候选药物存在的情况下,用人腺病毒感染Hela细胞。他们发现其中最有效的是黄酮哌啶醇,一种已知能抑制细胞周期依赖性激酶Cdk9的半合成类黄酮化合物。如下图A所示,在没有药物的情况下,腺病毒感染细胞后会诱导CPE发作,阻抗信号降低至零(红色曲线)。但是,黄酮哌啶醇以剂量依赖性方式能够显著延迟或阻断病毒CPE的发作(蓝色和橙色曲线)。这些基于阻抗检测的结果同时通过显微镜分析也得到了证实(下图B)。

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A和图B. 监测黄酮哌啶醇的抗病毒活性。HeLa细胞接种约50小时后,在不同浓度的黄酮哌啶醇存在下,使用人腺病毒株C5感染细胞(图A)。黄酮哌啶醇对腺病毒具有广泛的保护作用。同步进行成像实验,使用人腺病毒D37感染WI38肺成纤维细胞,四小时后加入或不加入黄酮哌啶醇。在48小时后,可以清楚地看到该药物已经阻止了细胞病变的发生。数据摘自参考文献3。

 

四、杀病毒剂研究

杀病毒剂可通过灭活固体表面(例如台面,门把手、手掌等)或液体悬浮液中存在的病毒来防止感染。比勒陀利亚大学的Venter及其同事使用xCELLigence RTCA系统用于评估杀病毒剂的功效。他们将市售的杀病毒剂与具有传染性的法氏囊病病毒(IBDV)孵育20分钟,再将该病毒连续稀释,并添加到预先接种Vero细胞的E-Plate孔板中。如下图所示,未经处理的病毒会引起细胞病变效应CPE,CPE的发作时间取决于病毒滴度,而使用杀病毒剂对IBDV预处理会后可以大大降低其感染能力。尽管结果显示10倍稀释的病毒依然可以诱导CPE,但是100倍或更大稀释倍数的IBDV对Vero细胞完全没有影响(图B)。通过大量实验研究,他们认为:“xCELLigence RTCA系统测定杀病毒剂功效的方法与传统杀病毒剂测定法所得结果完全一致,而且该方法可以更简洁快速,更精确地测定杀病毒剂的功效和及其自身的细胞毒性。”

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A和图B. 使用杀病毒剂保护Vero细胞免受IBDV侵害。未用杀病毒剂预处理(图A)或使用杀病毒剂预处理(图B)的IBDV感染的Vero细胞。暴露于杀病毒剂后,只有最浓的病毒溶液仍然能够诱导CPE(细胞病变作用)。病毒浓度表示为稀释倍数(即101=10倍稀释,102=100倍稀释等)。数据摘自参考文献4。

更多病毒研究应用将在下期继续推出。关注疫情,攻克难关,我们在行动!
 

参考文献

1. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. J Virol Methods. 2011 May;173(2):251-8.

2. Robust real-time cell analysis method for determining viral infectious titers during development of a viral vaccine production process. J Virol Methods. 2018 Feb;252:57-64.

3. Cell Cycle-Dependent Kinase Cdk9 Is a Postexposure Drug Target against Human Adenoviruses. ACS Infect Dis. 2017 Jun 9;3(6):398-405.

4. An improved method for determining virucidal efficacy of a chemical disinfectant using an electrical impedance assay. J Virol Methods. 2014 Apr;199:25-8.
 

 

 

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安捷伦科技公司(纽约证交所:A)是生命科学、诊断和应用化学市场领域的生产商,拥有50多年的敏锐洞察与创新经验,我们的仪器、软件、服务、解决方案能够为客户具挑战性的难题提供更可靠的答案。2019财年,安捷伦营业收入为56.1亿美元,全球员工数约为16,300人。

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安捷伦生物—原艾森生物,是生命科学研究高性能细胞分析平台生产商。xCELLigence实时细胞分析技术和NovoCyte、Quanteon流式细胞仪广泛运用于新药研发、免疫治疗、疫苗研发、毒理学、安全药理学、质控和基础生命科学研究,目前,在全球范围内已安装3000多台仪器,并有2000多篇经同行专家评审的高水平学术文献中被引用。

 

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2020年2月17日 10:14
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