实时无标记心肌细胞功能分析技术
在过去的近20多年中，一大批的药物因为具有心脏毒性而被撤除市场。另外，有一些化合物也因为在药物研发的后期或者临床应用阶段所发现的心脏毒性给医药产业带来巨大损失，也给人类健康造成很大危害。因此在药物研发的早期阶段对其心脏毒性进行筛选和评价，对降低新药的后期研发成本，提高新药研发的成功率有着重要的意义。药物的心脏副作用各不相同，但总体可以分为直接作用和间接作用。大多数的药物撤出市场是因为它们干扰心脏的电活动而影响心脏功能。心脏本身自发性电活动源于心肌细胞膜上的钠、钾、钙等离子有规律的活动，影响了这些离子通道的功能，会进一步对心脏的兴奋-收缩偶联产生影响而导致致命性的心率失常，称为尖端扭转型心动过速TdP (Torsades de Pointes)。
是否还有其他的分子机制引起TdP目前仍在研究之中，但广为人们接受的是药物引起的心室复极化时程延迟（或称为QT间期延长）是导致心律失常主要原因。人体中心室复极化的主要电流是快速激活延迟整流钾电流IKr，主要由hERG (human ether a-go-go related gene) 基因编码， 阻断hERG通道会引起心室肌动作电位时程的延长。异常的复极化过程会引起早后去极化(EAD，early after depolarization)，进而导致TdP。hERG通道在复极化过程中重要地位和它易于被药物结合的特性使得它成为心脏药物安全性评价的重要因素。
但值得注意的是，只评价药物对hERG通道的作用不足以全面预测药物的心脏毒性。因为有些药物对心肌细胞上的多种离子通道均有作用如verapamil。 研究药物心脏毒性的理想模型是，在体外有一个系统可以全面评价药物对心肌细胞兴奋-收缩偶联过程中所有的离子通道的作用，这对药物研发过程有着非常重要的指导作用。
ACEA自主研发的xCELLigence RTCA CardioECR仪器以48孔微孔板的形式，将阻抗检测与场电位记录整合为一体，是有史以来可同时实现离子通道活性与心肌舒缩力无损伤评估的第一个平台。该系统可对心肌细胞兴奋--收缩偶联过程进行综合性评价。专用软件用于鉴定和评估影响离子通道活性、心肌细胞舒缩力及细胞活力的不利因素，从而为心脏风险评估提供一个具有高度预测性的分析平台，从而为药物安全检测及优化提供了崭新的平台。xCELLigence RTCA CardioECR实时无标记心肌细胞功能分析仪由RTCA CardioECR检测分析仪和细胞检测板 (E-Plate CardioECR 48X) 两部分构成。做为细胞检测分析平台的装置放置于二氧化碳培养箱内，操控整个系统的运行并可进行数据收集及分析。
1. RTCA CardioECR实时无标记检测技术原理
RTCA（Real Time Cellular Analysis） 实时无标记细胞分析技术采用特殊工艺，将微金电极传感器阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部，用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测传感器系统。 当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时状态改变呈相关性，通过对阻抗值的实时检测从而获得与细胞生理功能相关的生物信息，包括细胞生长、伸展、形态变化、死亡和贴壁等。
xCELLigence RTCA CardioECR实时无标记细胞分析系统使用细胞指数（CI，Cell Index）这一参数表示细胞生理功能相关变化。定义为：细胞指数CI一个无量纲的参数，由RTCA测得的阻抗值通过标准公式推算获得，每个时间点的CI=(Rn-Rb)/15，其中Rn为孔内接种有细胞时的电阻抗值，Rb为孔内只有培养基时的背景阻抗值。细胞指数指示检测孔中的细胞活性，为细胞表型的综合检测指标。细胞指数所记录的内容反应了细胞数目，细胞大小，细胞贴壁状态及形态变化等方面的内容。当检测板细胞孔内没有细胞或细胞没有很好的黏附在电极上时，细胞指数CI为0；相同的生理条件下，黏附在此电极的细胞数目越多，细胞指数CI越大；此外，细胞状态的变化如黏附、生长及形态变化都会引起细胞指数CI变化。
E-Plate CardioECR 48X
微孔板在每个孔内整合有两种类型的电极：一类是新型的叉指微电极，提供阻抗值检测，从而能够高灵敏度、实时动态检测心肌细胞活力及舒缩力；另一类是点电极，提供胞外场电位检测，可与阻抗检测同时进行。该方法无需标记并可连续动态观察心肌细胞的生长与律动曲线及心肌细胞场电位。同时可以筛选与检测药物对心肌细胞功能的影响。该方法为全自动化定量数据采集，避免了标记对于心肌细胞本身的影响。
图1. RTCA实时无标记技术检测原理示意图。xCELLigence RTCA CardioECR系统检测板E-Plate CardioECR 48X及孔内底面微金电极传感器阵列（上）；当检测板细胞孔底面没有细胞存在时，电阻抗为0，细胞接种入孔内，随着细胞贴壁、伸展、细胞数目的增多，电阻抗值逐渐增大；心肌细胞收缩形态改变也会引起阻抗值变化。
2. RTCA CardioECR系统组成
xCELLigence® RTCA CardioECR实时无标记细胞分析仪由四部分组成：RTCA CardioECR分析仪、检测台、控制软件、细胞检测板 (E-Plate CardioECR 48X)。
图2. xCELLigence RTCA CardioECR实时无标记心肌细胞功能分析仪组成构件
l RTCA控制软件：xCELLigence 系统中的RTCA仪器由功能强大的RTCA专用的软件控制。RTCA CardioECR Software 1.0 提供了友好的用户界面对仪器进行控制与操作，包括实验设定，数据采集，数据显示，数据分析及结果输出，软件除了能记录心肌细胞生长过程外，还能记录其收缩舒张的动态曲线图，常见参数见图3。
l RTCA分析仪：阻抗分析仪操控整个系统的运行，进行数据采集及分析，最后通过RTCA CardioECR Software 1.0软件输出数据。
l RTCA检测台：RTCA检测台装置放置于二氧化碳培养箱内，内置1个E-Plate CardioECR48x检测板模块，对检测板每个孔的阻抗值进行连续检测和读取，记录心肌细胞的跳动过程及细胞场电位，并输出到RTCA分析仪进行收集和分析。
l E-Plate CardioECR 48x检测板：检测板底部整合有微金电子传感器芯片及点电极，当贴壁生长在微电极表面的心肌细胞收缩时，会引起电极界面阻抗及点电极电位的变化， 该阻抗值的变化直接反映心肌细胞的搏动参数及场电位变化。
图3. 软件自动计算心肌细胞搏动频率、幅度、波峰上升/下降时间，跳动持续时间及场电位等多参数。
二、xCELLigence RTCA CardioECR心肌细胞功能分析系统的应用
1. RTCA CardioECR 系统同时监测心肌细胞收缩力及综合离子通道活力
检测电压门控K+通道调节剂的作用
快速激活延迟整流钾电流(IKr) 在心肌动作电位3期复极化过程中发挥重要作用。如图7 所示，E4031（ERG通道抑制剂）对Cor.At® 细胞的作用，破坏了心肌细胞正常的跳动节律。在浓度较高时(200 ～800 nM)，引起细胞跳动时程的延长，这种现象是典型的hERG通道抑制剂的作用。在药物的某些浓度作用下，12h之后细胞的跳动曲线出现部分恢复的现象。E4031对细胞标准化跳动频率和跳动的规律性的半有效抑制浓度分别为27 nM和 57 nM，这一结果与使用膜片钳技术检测的结果一致。
图4. 系统可在毫秒级时间分辨率下，同时测量心肌舒缩力及综合离子通道活性。在线软件可实时输出数据，两组数据可独立显示，也可叠加分析。
2. RTCA CardioECR无损伤性阻抗及场电位检测，实现心肌细胞长时期活力评估
图5. 许多化合物如Anthracyclins等，已被证实具有长时性的结构心脏毒性。xCELLigence CardioECR系统能同时实现短时程及长时程持续监测，因此可应用于结构性心脏毒性的评估。该系统既可实现综合离子通道活性及心肌舒缩力在毫秒级时间分辨率下的短时程检测，也可完成长时程的心肌活力评估。
药物心脏毒性（drug induced CardioECRtoxicity），由外源性药物对心血管系统的造成多种复杂的病理生理损害，一直是临床、医药科研以及医药企业密切关注的热点。
药物的心脏副作用各不相同，心脏本身自发性电活动源于心肌细胞膜上的钠、钾、钙通道有规律的活动，影响了这些离子通道的功能，就会影响心脏的兴奋-收缩偶联，从而导致致命性的心率失常，也称为尖端扭转型心动过速TdP (Torsades de Pointes)。
但是，目前的大多检测技术，如竞争性配体结合实验；电压敏感的荧光染料标记实验；膜片钳检测系统等，这些模型和手段在检测通量、特异性、准确性、灵敏性等方面都各有一定的局限性，有的需要极高的技术要求，有的是损伤性检测，而且大多是使用的终点法进行检测。因此，在新药研发中需要建立更为理想的模型，在体外细胞水平上全面评价药物对心肌细胞兴奋-收缩偶联过程中所有的离子通道的作用。这对药物研发过程有着非常重要的指导作用。
RTCA CardioECR心肌细胞功能分析仪可以非常灵敏并定量地检测与心肌细胞兴奋-收缩偶联相关的离子通道和非离子通道调节剂的作用。实验中，在E-Plate CardioECR 48x检测板中接种Cor.At®心肌细胞，培养3天后加入不同浓度的药物，实时检测药物的作用。
检测电压门控Ca 2+ 通道调节剂的作用
Isradipine属于二氢吡啶类化合物，做为L-型钙离子通道的阻断剂，作用于心肌细胞后, 引起时间及浓度依赖的心肌细胞跳动抑制（图6）。Isradipine 对Cor.At® 细胞标准化跳动频率和幅度抑制的半有效抑制浓度分别为19.7 nM 和42.3 nM (药物作用后5min计算)，这一结果与使用体外急性分离的兔心肌细胞4以及稳定表达Cav1.2的HEK293中做出的实验结果是一致的。
检测电压门控Na+通道调节剂的作用
电压门控钠通道在心肌细胞动作电位0期去极化过程中发挥重要作用。TTX是一种电压门控钠通道的选择性抑制剂，作用于Cor.At® 细胞后，引起药物浓度依赖的细胞跳动频率降低。在较高浓度时，这种跳动抑制作用可一直持续到加药后12h (图7) 。由RTCA CardioECR心肌细胞功能分析仪测定结果计算的半有效抑制浓度为0.3 μM。
3. RTCA CardioECR起搏功能控制心肌细胞收缩频率
用户可自定义电起搏参数以实现对心肌细胞跳动的时间控制。
4. RTCA CardioECR 心肌细胞功能分析仪在药物临床前心脏安全性评价中的应用
目前，心血管安全性尤其是心律失常的风险评价作为新药上市所研究的项目之一。在药物研发的早期对其心脏毒性进行快速筛选与评价，对降低新药的后期研发成本，提高新药开发的成功率有着重要的意义，同时早期的筛选与评价结果也将为后期系统的安全性评价提供有益的参考，节约后期评价的动物和成本。
目前，检测药物引起的QT间期延长是药物开发临床前标准实验中主要检测项目之一。该检测主要基于药物毒性检测。hERG通道功能检测目前已成为药物开发早期的一项常规检测。
hERG钾离子通道介导心肌膜电位复极化, hERG的抑制会延长动作电位持续时间, 导致心律失常。目前大多药物研发者评价新药物的心脏毒性,通常首先检测其在心肌细胞系中是否抑制hERG钾离子通道的表达。但由于hERG的抑制并不总是导致QT间期延长, 因此单一检测hERG离子通道的表达会产生许多假阳性结果。例如维拉帕米(verapamil)可阻断hERG通道, 但也能同时抑制L-型钙离子通道。由于维拉帕米对这两种通道蛋白的双重作用, 导致其对QT间期影响甚小, 甚至会缩短QT间期。因此, 药物研发者需要更可靠的研究模型以减少由单一hERG离子通道检测带来的假阳性结果。
使用RTCA CardioECR心肌细胞功能分析仪，检测了4种因诱导心肌TdP而撤市的药物。结果表明这4种药物均影响细胞的跳动频率，并呈现药物浓度依赖性(图9)。药物引起的心肌细胞抑制作用结果与hERG通道抑制剂E4031很接近，提示这4种药物具有类似的作用机制，即直接抑制hERG通道。
此外，还检测了Pentamidine的作用。 Pentamidine是hERG蛋白转运过程的一种抑制剂，可以引起心肌复极化时程的延长，从而间接地影响hERG通道的功能，对于这类机制的药物，膜片钳技术在短短的几分钟内很难检测到。而RTCA CardioECR 心肌细胞功能分析仪检测到20uM Pentamidine作用于Cor.At® 细胞，240min内没有引起细胞跳动频率和幅度的明显变化，但作用900min后，跳动的频率明显减慢、单次跳动时程延长，提示Pentamidine作用于hERG蛋白的转运，影响了心肌细胞动作电位的复极化过程。这些结果再次证明了实时检测药物的作用对于预测药物短时和长时程作用具有非常重要的意义。
图10. RTCA CardioECR 心肌细胞功能分析仪检测药物心肌毒性。(A) RTCA CardioECR 心肌细胞功能分析仪检测药物droperide、astemizole、cisapride和 sertindole对Cor.At® 细胞的作用。图示为药物加入后30 min (droperide)、15 min (astemizole)、180 min (cisapride)和165 min (sertindole) 细胞的跳动曲线图 (时程均为5s)，除了cisapride从10uM， 1：2稀释以外，其他3种药物均从20uM开始 1：2稀释；(B) Cor.At® 细胞在E-Plate CardioECR 48 检测板中培养3天后用20μM的pentamidine处理，检测药物对Cor.At® 细胞跳动的影响。
5. 心肌细胞的诱导效率及细胞活性评估
胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)具有无限的自我更新能力和分化为三个胚层各种类型细胞的特性。研究表明 ESCs 可分化为包括心房肌、心室肌、房室结、蒲肯野氏细胞和窦房结样细胞等多种心肌组织细胞。这些特性不仅赋予了 ESCs在研究心肌细胞发生发育分子机制中的重要价值，而且为药物发现和毒性的检测提供了独特的模型，并可能为治疗心肌梗塞的细胞替代疗法以及心肌组织工程提供无限的供源。同时，来自多种体细胞的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs) 的建立，为再生医学带来了更为广阔的前景。然而，对 ESCs 和 iPSCs 向心肌细胞分化的调控机制的认识仍很有限， 二类细胞的自发分化效率也非常低。由于自发分化的效率低，近年来不少实验室致力优化培养条件和改进分化方案，以提高分化效率，并在认识影响和调控 ESCs 向心肌细胞分化的细胞内外因素的基础上改善自发分化过程。
图11. RTCA检测诱导房性及室性心肌细胞的活性。房性心肌细胞起跳相对较早，在接种后48hr已稳定跳动；室性心肌细胞在48hr大部分孔仍未跳动，360hr趋于平稳跳动，孔间具有较好的一致性。
通过xCELLigence实时心肌细胞功能分析仪可实时监测分化过程中细胞因子的时程表达对细胞命运决定的作用，可以采用更为有效的细胞因子的组合并在适合的时程促进心肌细胞的分化，从而进一步优化培养条件。
