肿瘤免疫与细胞治疗技术

继基因测序之后，细胞免疫治疗概念崛起。 随着国内外市场的监管成熟，细胞治疗产业将进入良性快速发展时期。免疫治疗主要包括：非特异性免疫刺激、免疫检验点单克隆抗体、过继T细胞疗法、肿瘤疫苗等方法。通过激发或调动机体的免疫功能，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞的目的，是继传统疗法（手术、化疗和放疗）、靶向疗法后肿瘤治疗领域又一项突出有效的治疗方式。

艾森生物技术公司的RN（RTCA+Novocyte）系统，为肿瘤免疫/细胞治疗提供了一个技术平台. 该系统由RTCA实时无标记细胞功能检测系统及Novocyte流式细胞仪组成，可以进行细胞水平-免疫细胞激活或基因修饰后，免疫细胞表面免疫受体的表达情况及对靶细胞的杀伤能力评价，从而给出完整的细胞治疗质量评价结果，为细胞治疗的基础研发及临床工作提供了一个科学的高效率工作平台.

1.1 RTCA实时无标记检测技术原理

RTCA（Real Time Cellular Analysis） 实时无标记细胞分析技术采用特殊工艺，将微金电极传感器阵列整合在细胞培养板的每个细胞生长孔底部，用以构建实时、动态、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变的细胞阻抗检测传感器系统。当贴壁生长在微电极表面的细胞引起贴壁电极界面阻抗的改变时，这种改变与细胞的实时状态改变呈相关性，通过对阻抗值的实时检测从而获得与细胞生理功能相关的生物信息，包括细胞生长、伸展、形态变化、死亡，贴壁及相关细胞代谢变化信息。

RTCA 实时无标记细胞分析系统使用细胞指数（CI，Cell Index）参数表示细胞生理功能相关变化。定义为：细胞指数CI一个无量纲的参数，由RTCA测得的阻抗值通过标准公式推算获得，每个时间点的CI=(Rn-Rb)/15，其中Rn为孔内接种有细胞时的电阻抗值，Rb为孔内只有培养基时的背景阻抗值。细胞指数指示检测孔中的细胞活性，为细胞表型的综合检测指标。细胞指数所记录的内容反应了细胞数目，细胞大小，细胞贴壁状态及形态变化等方面的内容。当检测板细胞孔内没有细胞或细胞没有很好的黏附在电极上时，细胞指数CI为0；相同的生理条件下，黏附在此电极的细胞数目越多，细胞指数CI越大；此外，细胞状态的变化如黏附、生长及形态变化都会引起细胞指数CI变化。

A.  RTCA系统检测板E-Plate 16及孔内底面微金电极传感器阵列

B.   RTCA实时无标记技术检测原理示意图。当检测板细胞孔底面没有细胞存在时，电阻抗为0，细胞接种入孔内，随着细胞贴壁、伸展、细胞数目的增多，电阻抗值逐渐增大；细胞形态变化也会引起阻抗值变化

图6 DC-CIK细胞对Bel7402细胞系杀伤实验

1.2 Novocyte流式细胞检测系统介绍

ACEA NovoCyte流式细胞仪是艾森生物（ACEA Biosciences）自主研发的一款智能化检测的新一代流式细胞分析，可插拔滤光片支持通道配置更改及灵活升级，原机升级，可实现三激光十三色荧光同时检测；选配自动加样系统，可实现24管及96x多孔板高速上样，大大提升临床检测样本效率。

高度智能化的NovoCyteTM系列流式细胞仪既可用于临床检验，如肿瘤、免疫性疾病的研究及检测、白血病分型、HIV检测等；也可用于生命科学的细胞研究，如倍体分析、细胞计数、DNA/RNA含量检测、细胞凋亡及周期分析检测、细胞免疫学研究、体外T细胞增殖分析、疫苗研发、细胞生物学研究、转染效率研究等。

（一）  NovoCyteTM  流式细胞仪主要性能特点

   1.   配置灵活，原机升级；检测通道自由组合，产品升级简便灵活，满足多样化需求

Ÿ 多种波长激光器选配：488nm/640nm/405nm，提供更广的荧光染料选择范围，可到三激光十三色；

Ÿ 滤光片和二向色反光片自由组合，荧光检测通道灵活升级；

2.   固定光路设计，确保检测稳定可靠

Ÿ 独特的光路系统，克服其他流式细胞仪光路复杂的缺陷；

Ÿ 新技术低功耗固态激光器，提供更好的光斑质量，使用寿命更长；

Ÿ 激光器自带TEC温度控制系统，不但可以加热激光，当激光器工作一定时间发热时，TEC功能可以自动给激光器降温，保证全程实验过程统一的激发效率及恒定的工作温度，同时延长使用寿命；

Ÿ 光路采用直接导入技术，相比光纤导入技术更优秀。光纤导入只在远离传输时可减少光子能量损失，但在机器内部这么短的距离下光子能量损失可忽略不计，光纤导入由于要重新设计和调整光路反而导致光子能量损失；

Ÿ 高精度锁紧防震装置，避免使用过程中振动引入的光路不稳定；

 3.   免调PMT增益电压，24位高动态检测范围

Ÿ 采用新一代高灵敏度、宽动态范围PMT；

Ÿ 高达107动态检测范围，超越常规流式细胞仪1000倍；

Ÿ 覆盖全部待检荧光和散射光信号范围，免除用户繁琐的PMT增益电压调节工作；

4.   配备自动加样装置，多样本检测简便高效

Ÿ 上样系统设计独特，兼容5ml流式管、1.5ml EP管等；

Ÿ 配备自动加样器，实现24管及/96x多孔板高速上样；

5.   数字化信号采集系统，高达35，000细胞/秒实际检测速率；

 6.   强大的NovoExpressTM软件提供高效数据采集、分析和报告功能

Ÿ 界面简洁，功能直观，模块化设计使实验流程一目了然；

Ÿ 仪器设置、数据采集、统计分析一体化；

Ÿ 多样本处理模式，可边测试边分析其他数据；

Ÿ 提供中英文操作界面，软件提供分析模板，预置报告模板，自动、批量生成报告；

7.  体积法绝对计数，无需任何配套试剂

Ÿ 注射器，控制样本体积量，直接进行体积法绝对计数；

Ÿ 无需绝对计数管和其它配置试剂；

 8.   荧光补偿方式：矩阵补偿、自动补偿、快速补偿、在线及离线补偿

Ÿ 多种补偿方式可选：矩阵补偿，自动补偿及快速补偿。自动补偿一键设置，自动计算荧光补偿矩阵，避免手工补偿误差；快速补偿通过滚动条快速调节，直观显示补偿结果；

Ÿ 在线及离线补偿，数据采集及补偿可同时进行，也可实验结束后对数据做补偿分析；

 9.   高灵敏度、高分辨率检测

Ÿ 高性能新型光电倍增管，有效增强荧光及散射光收集效率，荧光检测灵敏度： FITC<75 MESF, PE<50 MESF，颗粒检测范围0.2µm - 50µm；

Ÿ 光胶耦合物镜石英杯检测流路；金属合金流动室，稳定可靠，荧光分辨率，全峰宽变异系数CV<2%；

 10.   自动清洗消毒，液路实时监控，日常维护简便

Ÿ 开关机及样本检测结束自动触发清洗消毒流程，免除人工清洗流程。使用中也可一键启动全自动清洗消毒，方便维护；

Ÿ 压力传感器实时监测流速，液路防堵报警；

Ÿ 注射泵驱动，可提供更大驱动压力，不易堵管；

Ÿ 样本交叉污染率<0.1%;

流式细胞仪检测的细胞特性如下表

二、RN系统在肿瘤免疫/细胞治疗研究中的应用       

1. RTCA技术在肿瘤免疫/细胞治疗研究领域中的应用

      生物细胞在正常分裂增殖过程中具有一定的变异率，但突变的细胞不一定是恶变细胞，由恶变细胞形成的肿瘤是细胞分裂和分化障碍造成的结果。这些恶变细胞与原正常细胞有很多不同点（如伴有新的抗原），因而可引起机体的免疫应答。机体对肿瘤的免疫应答成为肿瘤免疫，包括免疫监视（immune surveillance）和免疫排斥。肿瘤免疫是机体在肿瘤抗原刺激以前对肿瘤具备的非特异性免疫和在刺激以后产生的特异性免疫的总和。

自然杀伤细胞（Nature Killer Cells, NK）是一类在肿瘤早期起作用的效应细胞，是机体肿瘤免疫的第一道防线。NK细胞介导的肿瘤免疫具有下列优势：（1）能自发性杀伤多种肿瘤细胞，具有广谱杀伤肿瘤细胞作用（2）无肿瘤特异性和MHC限制性。（3）NK细胞杀伤肿瘤的能力可被细胞因子所增强，包括干扰素，肿瘤坏死因子和白细胞介素-2。（4）通过ADCC作用杀伤IgG包裹的肿瘤细胞。检测NK细胞介导的细胞杀伤活性可以监测癌症、传染病及自身免疫性疾病的免疫活性。

抗体依赖细胞介导的细胞杀伤（ADCC）作用表达IgGFc受体的NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞等通过与结合在肿瘤细胞等靶细胞表面的IgG抗体的Fc段结合，从而杀伤靶细胞的作用。ADCC是单克隆抗体临床治疗肿瘤的重要机制和手段，对杀伤肿瘤细胞和预防肿瘤细胞血管转移具有重要意义。用单克隆抗体治疗时，肿瘤细胞表面相应抗原表达高，则治疗效果好；提高治疗性克隆抗体血清水平或降低正常生理抗体血清水平可增强ADCC抗肿瘤效应。

传统NK细胞介导的细胞杀伤及ADCC作用检测方法为51Cr或111ln进行放射性标记分析。这些方法中，靶细胞被放射性同位素标记，然后与效应细胞混合。在给定时间检测放射性同位素的释放。也可用其他非放射性标记方法如流式细胞术、基于ELISA的颗粒酶测量，及利用显微镜进行形态学分析。RTCA技术在无需任何标记的情况下，可实现动态检测NK细胞杀伤及ADCC。RTCA技术基于电阻抗原理，针对贴壁细胞生物学表性进行检测，而对于加入孔内的悬浮细胞，因其不与检测板底面电极接触或近视微弱接触，所以不会引起电阻抗变化。

因此，NK细胞介导的单层癌细胞杀伤可直接利用RTCA技术进行定量监测，同时，可完成ADCC相关抗体高通量筛选及基础研究，指导抗体联合用药，为NK细胞介导的临床肿瘤治疗及单克隆抗体治疗研究提供重要的依据。

图2. RTCA技术检测NK细胞介导的细胞杀伤检测原理。A靶细胞接种于E-Plates上，每孔100ul培养基，使用RTCA技术系统动态监测细胞直至对数生长期，此时靶细胞形成细胞层；B.不同浓度的NK效应细胞直接加入到含有靶细胞的各孔中，NK效应细胞加入到不含靶细胞的孔作为对照；C.加入效应细胞后，每隔15min记录一次测定结果，连续记录靶细胞反应。

图3. RTCA系统动态检测NK细胞介导的细胞杀伤。A. NIH3T3细胞接种于E-Plate检测板，按一定比例加入NK细胞及YAC细胞（对照组），可见NK细胞比例越高，引起的细胞杀伤作用越强。B为对检测板孔内细胞进行甲醛固定及Giemsa染色后显微镜下观察结果，与RTCA检结果一致。 资料来源：Zhu J., et al. Dynamic and label-free monitoring of natural killer cell cytotoxic activity using electronic cell sensor arrays. J Immunol Methods. 2006 Feb 20;309(1-2):25-33.

图4. RTCA技术动态检测曲妥单抗Trastuzumab对BT-474细胞（A）和具有曲妥单抗Trastuzumab抗性的B-T474细胞（B）在不同条件下的杀伤。不同浓度Trastuzumab处理细胞：10g/ml，1g/ml，0.1g/ml分别处理两类BT-474细胞，（A）显示对Trastuzumab敏感的细胞经药物处理后产生一定的杀伤作用，而对Trastuzumab不敏感的细胞对药物几乎未发生反应。对两类细胞分别加入NK细胞和0.1g/ml Trastuzumab联合用药处理，均能增强药物对细胞的杀伤。（C）显示，单独加入NK细胞及Trastuzumab均能导致一定程度细胞杀伤，但二者联合作用后杀伤效力更强。（D）显示，对药物不敏感的细胞单独加入Trastuzumab后，不对细胞产生杀伤，单独加入NK细胞能产生一定程度的杀伤，二者联合计入后，细胞杀伤效力增强。

NK免疫法之后，出现了DC-CIK免疫法。树突状细胞（Dendritic cells，DC）是专职抗原提呈细胞, DC是激发B和T淋巴细胞介导的免疫反应的重要的专职抗原提呈细胞。DC能活跃地摄取一系列不同的抗原物质，并进行加工和装载到MHCI和II类分子上。CIK细胞瞄准白血病细胞，需要人体内另一种细胞树突状细胞（DC）的指导。树突状细胞能识别处理白血病细胞，并把白血病细胞的相关信号传递给CIK细胞，使CIK细胞专门杀伤白血病细胞。所以，树突状细胞能显著提高CIK细胞针对白血病细胞的杀伤活性。白血病患者受本身疾病和化疗的影响，其树突状细胞识别处理白血病细胞的功能受到很大影响。为了恢复和提高树突状细胞的功能，指导CIK细胞杀伤白血病细胞，体外DC-CIK细胞联合培养技术应运而生，这是CIK细胞治疗的又一进展。

图5 DC-CIK细胞对HepG2细胞系杀伤实验

图6 DC-CIK细胞对Bel7402细胞系杀伤实验

       继NK及DC-CIK疗法之后，出现了新一代，以CAR-T为代表的细胞疗法。该技术具有的靶向性，具有更高的靶细胞识别能力及杀伤能力。CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。是近些年国内外热门的新型细胞疗法。和其它免疫疗法类似，它的基本原理就是利用病人自身的T细胞，进行基因改造为嵌合抗原受体T细胞，来进行高度靶向性清除。临床应用的有效性和安全性一直是CAR-T细胞疗法较为关注和争论的点。CAR-T细胞疗法之父Carl June，利用RTCA MP高通量实时无标记系统，建立了免疫细胞杀伤能力质控标准，对不同靶向的CAR-T cell的靶细胞杀伤效果评价。

图7特异性识别靶细胞CD19的T cell对293细胞及高表达CD19的293细胞的选择杀伤能力及效靶比实验

综上所述，RTCA实时动态检测系统为以NK/DC-CIK/CAR-T为代表的肿瘤免疫/细胞治疗研究及抗体联合用药相关检测提供了一个有力的平台。

2.Novocyte在细胞免疫中的应用

2.1淋巴瘤免疫检测及分型

    白血病是一种高度异质性的造血系统肿瘤，主要累及造血干细胞及造血祖细胞，由于各种疾病原因导致造血干/祖细胞不能正常分化成熟，阻滞于发育的某个阶段，在骨髓、外周血中出现大量幼稚或者不完全成熟髓系或者淋巴系细胞。骨髓血细胞是形态学分型的基础，流式细胞术白血病分型是对形态学分型的重要补充和进一步深化，国际白血病MIC分型协作组认为免疫分型对每一例急性白血病都是必不可少的，对于下列情况，意义更大：1）用形态学和细胞化学染色不能肯定细胞来源的白血病。2）形态学为急性淋巴细胞白血病（ALL）或急性未分化白血病（AUL）但缺乏特异性细胞抗原标记。3）混合型白血病。4)部分髓系白血病。5）淋巴细胞白血病。6）微小残留白血病。淋巴瘤起源于淋巴结和淋巴组织，其发生大多数与免疫应答过程中淋巴细胞增殖分化产生的某种淋巴细胞恶变有关，是免疫系统的恶性肿瘤。目前已知淋巴瘤有近70种病理类型，可分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。在我国，非霍奇金淋巴瘤占所有淋巴瘤病理的90%左右。根据WHO分型标准，所有非霍奇金淋巴瘤都具有独特的基于形态学、免疫学分型、遗传学及临床表现的临床病理学特征。使用流式可以同时检测多种细胞表面抗原，用极少量样本分析抗原的表达，与形态学及遗传学互为补充，获得准确的检测信息。

 检测原理

正常造血细胞发育不同阶段的抗原表达是受一系列基因精密调控的，在一定分化阶段哪些抗原表达及抗原表达量的多少存在明显的规律性。白血病是造血系统的恶性肿瘤，是造血系统某一系或者多系细胞分化阻滞于某一阶段，出现恶性增殖性克隆，可根据该恶性克隆细胞群的抗原表达谱对其进行系别和分化阶段的鉴定。流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标记的单克隆抗体作为探针，多参数分析白血病细胞的细胞膜和细胞浆或者细胞核的免疫表型，以此鉴别白血病细胞所属细胞系别及分化程度。

       白血病免疫分型4色方案

图8 通过CD4/SSC圈门，幼稚细胞群P2，占有核细胞比例为64.2%，表达HLA-DR，CD19，CD10，cCD79a，CD34，部分表达CD22，CD33，CD13，不表达CD7，CD117，CD5,CD20,CD103,CD11c,CD71,cyIgM

2.2淋巴亚群检测

机体的免疫是由免疫器官、免疫细胞（淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞等）及其免疫分子组成的维持机体免疫生理平衡的防御性体系。免疫系统各组分的正常是维持机体免疫功能相对稳定的保证。其中，淋巴细胞是构成机体免疫器官的基本单位，在免疫应答过程中起核心作用。正常情况下，各淋巴亚群（T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞）保持一定的数量和比例，相互作用和调节，共同维持机体的免疫功能。当不同的淋巴亚群的数量和比例发生异常改变时，机体就会产生一系列病理变化和免疫失调，导致疾病发生。对淋巴细胞及亚型所占百分数及绝对含量的检测，是检测机体免疫功能的重要指标，可以了解机体的免疫功能状态，对疾病的诊断及鉴别、预后判断都十分重要，也可以辅助诊断某些疾病（如自身免疫疾病、免疫缺陷病、恶性肿瘤、血液病、变态反应性疾病等），对机体的亚健康状态的诊断及发生疾病的风险评估，也具有重要意义。

检测原理

利用单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，即可以把不同功能的淋巴细胞亚群区分开来，得到各亚群的相对比例及绝对数量。较常检测的亚群包括T细胞（CD3）、B细胞（CD19）、NK细胞（CD16+56）、辅助性T细胞（CD3+CD4+）和抑制性T细胞（CD3+CD8+）等。

   图9 应用四色抗体组合CD3FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4APC CD3FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19APC 进行多色淋巴亚群检测，分析总淋巴细胞（CD45+），总T淋巴细胞（CD3+），T辅助淋巴细胞（CD3+CD4+），T抑制淋巴细胞（CD3+CD8+），NK细胞（CD3-CD16+CD56+），B细胞（CD3-CD19+）比例（%）及绝对浓度（个/ul）